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Les thermophiles sont des micro-organismes qui prospèrent à des températures élevées. Leur étude peut fournir des informations précieuses sur la façon dont la vie s’adapte aux conditions extrêmes. Cependant, il est difficile d’obtenir des conditions de température élevée avec les microscopes optiques classiques. Plusieurs solutions artisanales basées sur un chauffage électrique résistif local ont été proposées, mais il n'existe pas de solution commerciale simple. Dans cet article, nous introduisons le concept de chauffage laser à micro-échelle sur le champ de vision du microscope afin de fournir des températures élevées pour les études thermophiles tout en gardant l'environnement de l'utilisateur doux. Un chauffage à l’échelle microscopique à une intensité laser modérée peut être obtenu en utilisant un substrat recouvert de nanoparticules d’or comme absorbeur de lumière biocompatible et efficace. Les effets possibles de la convection des fluides à l'échelle microscopique, de la rétention cellulaire et du mouvement thermophorétique centrifuge sont discutés. La méthode a été démontrée chez deux espèces : (i) Geobacillus stearothermophilus, une bactérie thermophile active qui se reproduit à environ 65°C, et que nous avons observée germer, croître et nager sous un chauffage à micro-échelle ; (ii) Thiobacillus sp., une archée hyperthermophile optimale. à 80°C. Ces travaux ouvrent la voie à une observation simple et sûre des micro-organismes thermophiles à l’aide d’outils de microscopie modernes et abordables.
Au fil des milliards d’années, la vie sur Terre a évolué pour s’adapter à un large éventail de conditions environnementales parfois considérées comme extrêmes du point de vue humain. En particulier, certains micro-organismes thermophiles (bactéries, archées, champignons) appelés thermophiles se développent dans une plage de températures allant de 45 °C à 122 °C1, 2, 3, 4. Les thermophiles vivent dans divers écosystèmes, tels que les sources hydrothermales des grands fonds, les sources chaudes. ou des zones volcaniques. Leurs recherches ont suscité beaucoup d’intérêt au cours des dernières décennies pour au moins deux raisons. Premièrement, nous pouvons en apprendre, par exemple, comment les thermophiles 5, 6, les enzymes 7, 8 et les membranes 9 sont stables à des températures aussi élevées, ou comment les thermophiles peuvent résister à des niveaux extrêmes de rayonnement10. Deuxièmement, ils sont à la base de nombreuses applications biotechnologiques importantes1,11,12 telles que la production de carburants13,14,15,16, la synthèse chimique (dihydro, alcools, méthane, acides aminés, etc.)17, la bioexploitation minière18 et les biocatalyseurs thermostables7,11, 13. En particulier, la réaction en chaîne par polymérase (PCR)19, actuellement bien connue, implique une enzyme (Taq polymérase) isolée de la bactérie thermophile Thermus Aquacus, l'une des premières thermophiles découvertes.
Cependant, l’étude des thermophiles n’est pas une tâche facile et ne peut s’improviser dans aucun laboratoire de biologie. En particulier, les thermophiles vivants ne peuvent pas être observés in vitro avec un microscope optique standard, même avec des chambres chauffantes disponibles dans le commerce, généralement conçues pour des températures aussi basses que 40°C. Depuis les années 1990, seuls quelques groupes de recherche se sont consacrés à l'introduction de systèmes de microscopie à haute température (HTM). En 1994, Glukh et al. La chambre de chauffage/refroidissement a été conçue sur la base de l'utilisation d'une cellule Peltier qui contrôle la température de capillaires rectangulaires fermés pour maintenir l'anaérobicité 20 . L’appareil peut être chauffé jusqu’à 100 °C à une vitesse de 2 °C/s, permettant aux auteurs d’étudier la motilité de la bactérie hyperthermophile Thermotoga maritima21. En 1999, Horn et coll. Un dispositif très similaire a été développé, toujours basé sur l'utilisation de capillaires chauffés adaptés à la microscopie commerciale pour étudier la division/connexion cellulaire. Après une longue période de relative inactivité, la recherche de HTM efficaces a repris en 2012, notamment en lien avec une série d'articles du groupe Wirth utilisant un dispositif inventé par Horn et al. Il y a quinze ans, la motilité d’un grand nombre d’archées, dont les hyperthermophiles, a été étudiée à des températures allant jusqu’à 100°C à l’aide de capillaires chauffés23,24. Ils ont également modifié le microscope d'origine pour obtenir un chauffage plus rapide (plusieurs minutes au lieu de 35 minutes pour atteindre la température réglée) et obtenir un gradient de température linéaire de plus de 2 cm à travers le milieu. Ce dispositif de mise en forme du gradient de température (TGFD) a été utilisé pour étudier la mobilité de nombreux thermophiles au sein de gradients de température à des distances biologiquement pertinentes 24, 25.
Chauffer des capillaires fermés n’est pas le seul moyen d’observer des thermophiles vivants. En 2012, Kuwabara et al. Des chambres Pyrex jetables faites maison scellées avec un adhésif résistant à la chaleur (Super X2; Cemedine, Japon) ont été utilisées. Les échantillons ont été placés sur une plaque chauffante transparente disponible dans le commerce (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japon) capable de chauffer jusqu'à 110°C, mais non destinée à l'origine à la bioimagerie. Les auteurs ont observé une division efficace des bactéries thermophiles anaérobies (Thermosipho globiformans, temps de doublement 24 min) à 65°C. En 2020, Pulshen et al. Le chauffage efficace de plats métalliques commerciaux (AttofluorTM, Thermofisher) a été démontré à l'aide de deux éléments chauffants faits maison : un couvercle et une platine (configuration inspirée de la machine PCR). Cette association se traduit par une température du liquide uniforme et évite l'évaporation et la condensation au fond du couvercle. L'utilisation d'un joint torique évite les échanges gazeux avec l'environnement. Ce HTM, appelé Sulfoscope, a été utilisé pour imager Sulfolobus acidocaldarius à 75°C27.
Une limitation reconnue de tous ces systèmes était la restriction à l'utilisation d'objectifs aériens, toute immersion dans l'huile étant inadaptée à des températures aussi élevées et à l'imagerie à travers des échantillons transparents d'une épaisseur supérieure à 1 mm. Une limitation reconnue de tous ces systèmes était la restriction à l'utilisation d'objectifs aériens, toute immersion dans l'huile étant inadaptée à des températures aussi élevées et à l'imagerie à travers des échantillons transparents d'une épaisseur supérieure à 1 mm. L'installation de tous les systèmes comprend la gestion de l'utilisation de vos objets, pour le travail d'immersion Nie в масло не подходило на такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщиной > 1 мм. Un inconvénient reconnu de tous ces systèmes était la limitation de l'utilisation d'objectifs aériens, car toute immersion dans l'huile n'était pas adaptée à des températures aussi élevées et à la visualisation à travers des échantillons transparents > 1 mm d'épaisseur.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1米厚的透明样品成像。 Une limitation reconnue de tous ces systèmes est la limitation de l’utilisation d’un miroir à air entraîné, car toute immersion dans l’huile n’est pas adaptée à l’imagerie d’échantillons transparents > 1 mm d’épaisseur à des températures aussi élevées. Le système actuel utilise tous les objets nécessaires à l'immersion масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. Un inconvénient reconnu de tous ces systèmes est l’utilisation limitée de lentilles à air ; toute immersion dans l’huile est inadaptée à des températures aussi élevées et à la visualisation à travers des échantillons transparents > 1 mm d’épaisseur.Plus récemment, cette limitation a été levée par Charles-Orzag et al. 28, qui a développé un dispositif qui ne fournit plus de chaleur autour du système d'intérêt, mais plutôt à l'intérieur du verre de protection lui-même, recouvert d'une fine couche transparente d'une résistance en ITO (oxyde d'indium-étain). Le couvercle peut être chauffé jusqu'à 75 °C en faisant passer un courant électrique à travers la couche transparente. Cependant, l'auteur doit également chauffer l'objectif jusqu'à l'objectif, mais pas à plus de 65 °C, afin de ne pas l'endommager.
Ces travaux montrent que le développement d'une microscopie optique à haute température efficace n'a pas été largement adopté, nécessite souvent des équipements faits maison et se fait souvent au détriment de la résolution spatiale, ce qui constitue un sérieux inconvénient étant donné que les micro-organismes thermophiles ne sont pas plus grands que quelques micromètres. La réduction du volume de chauffage est la clé pour résoudre trois problèmes inhérents au HTM : une mauvaise résolution spatiale, une inertie thermique élevée lorsque le système chauffe et un échauffement nocif des éléments environnants (huile d'immersion, lentille d'objectif… ou mains de l'utilisateur) à des températures extrêmes. ).
Dans cet article, nous introduisons un HTM pour l'observation thermophile qui n'est pas basé sur le chauffage résistif. Au lieu de cela, nous avons obtenu un échauffement localisé dans une région limitée du champ de vision du microscope par irradiation laser d'un substrat absorbant la lumière. La distribution de température a été visualisée par microscopie en phase quantitative (QPM). L'efficacité de cette méthode est démontrée par Geobacillus stearothermophilus, une bactérie thermophile mobile qui se reproduit à environ 65°C et a un temps de doublement court (environ 20 minutes), et Sulfolobus shibatae, une hyperthermophile qui se développe de manière optimale à 80°C (archées). pour illustrer. Un taux de réplication et une nage normaux ont été observés en fonction de la température. Ce laser HTM (LA-HTM) n'est limité ni par l'épaisseur de la lamelle ni par la nature de l'objectif (immersion dans l'air ou dans l'huile). Cela permet d’utiliser n’importe quel objectif haute résolution du marché. Il ne souffre pas non plus d'un chauffage lent dû à l'inertie thermique (il permet un chauffage instantané à l'échelle de la milliseconde) et utilise uniquement des composants disponibles dans le commerce. Les seuls nouveaux problèmes de sécurité sont liés à la présence de faisceaux laser puissants (généralement jusqu'à 100 mW) à l'intérieur de l'appareil et éventuellement à travers les yeux, qui nécessitent des lunettes de protection.
Le principe du LA-HTM est d'utiliser un laser pour chauffer l'échantillon localement dans le champ de vision du microscope (Fig. 1a). Pour ce faire, l’échantillon doit absorber la lumière. Pour utiliser une puissance laser raisonnable (inférieure à 100 mW), nous ne nous sommes pas appuyés sur l'absorption de la lumière par le milieu liquide, mais avons artificiellement augmenté l'absorption de l'échantillon en recouvrant le substrat de nanoparticules d'or (Fig. 1c). Chauffer des nanoparticules d'or avec de la lumière revêt une importance fondamentale dans le domaine de la plasmonique thermique, avec des applications attendues en biomédecine, en nanochimie ou en récolte de lumière solaire29,30,31. Au cours des dernières années, nous avons utilisé ce LA-HTM dans plusieurs études liées aux applications des plasmas thermiques en physique, chimie et biologie. La principale difficulté de cette méthode réside dans l’affichage du profil de température final, puisque la température élevée est limitée à une région à l’échelle microscopique au sein de l’échantillon. Nous avons montré que la cartographie de la température peut être réalisée avec l'interféromètre à cisaillement transversal à quatre longueurs d'onde, une méthode simple, haute résolution et très sensible de microscopie de phase quantitative basée sur l'utilisation de réseaux de diffraction bidimensionnels (également appelés réseaux croisés). 33,34,35,36. La fiabilité de cette technique de microscopie thermique, basée sur la microscopie à front d'onde à réseau croisé (CGM), a été démontrée dans une douzaine d'articles publiés au cours de la dernière décennie37,38,39,40,41,42,43.
Schéma d'installation d'un microscope parallèle de chauffage, de mise en forme et de température au laser. b Géométrie de l'échantillon constitué d'une chambre AttofluorTM contenant une lamelle recouverte de nanoparticules d'or. c Regardez attentivement l'échantillon (pas à l'échelle). d représente le profil uniforme du faisceau laser et (e) la distribution ultérieure simulée de la température sur le plan échantillon des nanoparticules d’or. f est un profil de faisceau laser annulaire adapté pour générer une température uniforme, comme le montre la simulation de la distribution de température résultante présentée en (g). Barre d'échelle : 30 µm.
En particulier, nous avons récemment réalisé le chauffage de cellules de mammifères avec LA-HTM et CGM et suivi les réponses cellulaires aux chocs thermiques dans la plage de 37 à 42°C, démontrant l'applicabilité de cette technique à l'imagerie de cellules vivantes uniques. Cependant, l'application du LA-HTM à l'étude des micro-organismes à haute température n'est pas sans ambiguïté, car elle nécessite plus de prudence que les cellules de mammifères : d'une part, chauffer le fond du milieu de plusieurs dizaines de degrés (au lieu de quelques degrés) conduit à à un fort gradient vertical de température. peut créer une convection fluide 44 qui, si elle n'est pas fermement fixée au substrat, peut provoquer un mouvement et un mélange indésirables de bactéries. Cette convection peut être éliminée en réduisant l'épaisseur de la couche liquide. À cette fin, dans toutes les expériences présentées ci-dessous, des suspensions bactériennes ont été placées entre deux lamelles d'environ 15 µm d'épaisseur placées à l'intérieur d'une coupelle métallique (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b, c). En principe, la convection peut être évitée si l’épaisseur du liquide est inférieure à la taille du faisceau du laser chauffant. Deuxièmement, travailler dans une géométrie aussi limitée peut étouffer les organismes aérobies (voir Fig. S2). Ce problème peut être évité en utilisant un substrat perméable à l'oxygène (ou à tout autre gaz vital), en laissant des bulles d'air emprisonnées à l'intérieur de la lamelle ou en perçant des trous dans la lamelle supérieure (voir Fig. S1) 45. Dans cette étude, nous avons choisi cette dernière solution (Figures 1b et S1). Enfin, le chauffage laser n’assure pas une répartition uniforme de la température. Même à la même intensité du faisceau laser (Fig. 1d), la distribution de température n'est pas uniforme, mais ressemble plutôt à la distribution gaussienne due à la diffusion thermique (Fig. 1e). Lorsque l'objectif est d'établir des températures précises dans le champ de vision pour étudier les systèmes biologiques, des profils inégaux ne sont pas idéaux et peuvent également conduire à un mouvement thermophorétique des bactéries si elles n'adhèrent pas au substrat (voir Fig. S3, S4)39. À cette fin, nous avons utilisé un modulateur spatial de lumière (SLM) pour façonner le faisceau laser infrarouge en fonction de la forme de l'anneau (Fig. 1f) dans le plan de l'échantillon afin d'obtenir une répartition parfaitement uniforme de la température dans une zone géométrique donnée. malgré la diffusion thermique (Fig. 1d) 39, 42, 46. Placez une lamelle supérieure sur un plat métallique (Figure 1b) pour éviter l'évaporation du milieu et observez pendant au moins quelques jours. Parce que cette lamelle supérieure n’est pas scellée, un milieu supplémentaire peut être facilement ajouté à tout moment si nécessaire.
Pour illustrer le fonctionnement de LA-HTM et démontrer son applicabilité dans la recherche thermophile, nous avons étudié la bactérie aérobie Geobacillus stearothermophilus, qui a une température de croissance optimale d'environ 60 à 65°C. La bactérie possède également des flagelles et la capacité de nager, fournissant un autre indicateur de l’activité cellulaire normale.
Les échantillons (Fig. 1b) ont été pré-incubés à 60 ° C pendant une heure, puis placés dans un porte-échantillon LA-HTM. Cette pré-incubation est facultative, mais toujours utile, pour deux raisons : premièrement, lorsque le laser est allumé, les cellules se développent et se divisent immédiatement (voir le film M1 dans Matériel supplémentaire). Sans pré-incubation, la croissance bactérienne est généralement retardée d'environ 40 minutes chaque fois qu'une nouvelle zone d'observation est chauffée sur l'échantillon. Deuxièmement, la pré-incubation d'une heure a favorisé l'adhésion des bactéries à la lamelle, empêchant les cellules de dériver hors du champ de vision en raison de la thermophorèse lorsque le laser était allumé (voir le film M2 dans Matériel supplémentaire). La thermophorèse est le mouvement de particules ou de molécules le long d’un gradient de température, généralement du chaud au froid, et les bactéries ne font pas exception43,47. Cet effet indésirable est éliminé sur une zone donnée en utilisant SLM pour façonner le faisceau laser et obtenir une répartition plate de la température.
Sur la fig. La figure 2 montre la distribution de température mesurée par CGM obtenue en irradiant un substrat de verre recouvert de nanoparticules d'or avec un faisceau laser annulaire (Fig. 1f). Une répartition plate de la température a été observée sur toute la zone couverte par le faisceau laser. Cette zone a été réglée à 65°C, la température optimale de croissance. En dehors de cette région, la courbe de température tombe naturellement à \(1/r\) (où \(r\) est la coordonnée radiale).
une carte de température des mesures CGM obtenue en utilisant un faisceau laser annulaire pour irradier une couche de nanoparticules d'or afin d'obtenir un profil de température plat sur une zone circulaire. b Isotherme de la carte de température (a). Le contour du faisceau laser est représenté par un cercle en pointillés gris. L'expérience a été répétée deux fois (voir Matériel supplémentaire, Figure S4).
La viabilité des cellules bactériennes a été surveillée pendant plusieurs heures à l'aide de LA-HTM. Sur la fig. 3 montre l'intervalle de temps pour quatre images tirées d'un film de 3 heures 20 minutes (Film M3, Informations supplémentaires). Il a été observé que les bactéries proliféraient activement dans la zone circulaire définie par le laser où la température était optimale, approchant les 65°C. En revanche, la croissance cellulaire était considérablement réduite lorsque la température descendait en dessous de 50 °C pendant 10 s.
Images de profondeur optique de bactéries G. stearothermophilus se développant après chauffage laser à différents moments, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, sur 200 Extrait d'un film d'une minute (film M3 fourni dans les informations supplémentaires) superposé à la carte de température correspondante. Le laser s'allume au temps \(t=0\). Des isothermes ont été ajoutées à l'image d'intensité.
Pour quantifier davantage la croissance cellulaire et sa dépendance à la température, nous avons mesuré l'augmentation de la biomasse de diverses colonies de bactéries initialement isolées dans le champ de vision Movie M3 (Fig. 4). Les bactéries parentales sélectionnées au début de la formation de mini-colonies formant unités (mCFU) sont présentées à la figure S6. Les mesures de masse sèche ont été prises avec une caméra CGM 48 qui a été utilisée pour cartographier la distribution de température. La capacité du CGM à mesurer le poids sec et la température constitue la force du LA-HTM. Comme prévu, la température élevée a entraîné une croissance bactérienne plus rapide (Fig. 4a). Comme le montre le tracé semi-logarithmique de la figure 4b, la croissance à toutes les températures suit une croissance exponentielle, où les données utilisent la fonction exponentielle \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), où \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – temps de génération (ou temps de doublement), \( g =1/ \tau\) – taux de croissance (nombre de divisions par unité de temps). Sur la fig. La figure 4c montre le taux de croissance et le temps de génération respectifs en fonction de la température. Les mCFU à croissance rapide se caractérisent par une saturation de la croissance après deux heures, un comportement attendu en raison de la densité bactérienne élevée (similaire à la phase stationnaire dans les cultures liquides classiques). La forme générale \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) correspond à la courbe biphasée attendue pour G. stearothermophilus avec un taux de croissance optimal autour de 60-65°C. Faites correspondre les données à l'aide d'un modèle cardinal (Figure S5)49 où \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2 ; 40 ± 4 ; 65 ± 1,6 ; 67 ± 3) °C, ce qui concorde bien avec d'autres valeurs citées dans la littérature49. Bien que les paramètres dépendants de la température soient reproductibles, le taux de croissance maximal de \({G}_{0}\) peut varier d'une expérience à l'autre (voir figures S7 à S9 et film M4). Contrairement aux paramètres d'ajustement de la température, qui devraient être universels, le taux de croissance maximal dépend des propriétés du milieu (disponibilité des nutriments, concentration en oxygène) au sein de la géométrie microscopique observée.
a Croissance microbienne à différentes températures. mCFU : Unités Formant des Colonies Miniatures. Données obtenues à partir d'une vidéo d'une seule bactérie se développant dans un gradient de température (film M3). b Identique à (a), échelle semi-logarithmique. c Taux de croissance\(\tau\) et temps de génération\(g\) calculés à partir de la régression linéaire (b). Barres d'erreur horizontales : plage de températures sur laquelle les mCFU se sont développées dans le champ de vision pendant la croissance. Barres d'erreur verticales : erreur type de régression linéaire.
En plus de la croissance normale, certaines bactéries apparaissent parfois pendant le chauffage au laser, ce qui est un comportement attendu pour les bactéries dotées de flagelles. Le film M5 en informations complémentaires montre de telles activités de natation. Dans cette expérience, un rayonnement laser uniforme a été utilisé pour créer un gradient de température, comme le montrent les figures 1d, e et S3. La figure 5 montre deux séquences d'images sélectionnées dans le film M5 montrant qu'une bactérie présente un mouvement directionnel tandis que toutes les autres bactéries restent immobiles.
Les deux périodes (a) et (b) montrent la nage de deux bactéries différentes marquées de cercles en pointillés. Les images ont été extraites du film M5 (fourni comme matériel supplémentaire).
Dans le cas de G. stearothermophilus, le mouvement actif des bactéries (Fig. 5) a commencé quelques secondes après l'allumage du faisceau laser. Cette observation souligne la réponse temporelle de ce micro-organisme thermophile à une augmentation de température, comme déjà observé par Mora et al. 24 . Le sujet de la motilité bactérienne et même de la thermotaxie peut être approfondi en utilisant LA-HTM.
La nage microbienne ne doit pas être confondue avec d'autres types de mouvements physiques, à savoir (i) le mouvement brownien, qui apparaît comme un mouvement chaotique sans direction définie, (ii) la convection 50 et la thermophorèse 43, consistant en une dérive régulière du mouvement le long d'une température. pente.
G. stearothermophilus est connu pour sa capacité à produire des spores très résistantes (formation de spores) lorsqu'elles sont exposées à des conditions environnementales défavorables comme moyen de défense. Lorsque les conditions environnementales redeviennent favorables, les spores germent, formant des cellules vivantes et reprenant leur croissance. Bien que ce processus de sporulation/germination soit bien connu, il n’a jamais été observé en temps réel. En utilisant LA-HTM, nous rapportons ici la première observation d’événements de germination chez G. stearothermophilus.
Sur la fig. La figure 6a montre des images accélérées de profondeur optique (OT) obtenues à l'aide d'un ensemble CGM de 13 spores. Pendant toute la durée de collecte (15 h 6 min, \(t=0\) – début du chauffage laser), 4 des 13 spores ont germé, à des instants successifs \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' et \(11\) h \(30\)'. Bien qu'un seul de ces événements soit représenté sur la figure 6, 4 événements de germination peuvent être observés dans le film M6 dans le matériel supplémentaire. Il est intéressant de noter que la germination semble être aléatoire : toutes les spores ne germent pas et ne germent pas en même temps, malgré les mêmes changements dans les conditions environnementales.
a Time-lapse composé de 8 images OT (immersion dans l'huile, 60x, objectif 1,25 NA) et (b) évolution de la biomasse des agrégats de G. stearothermophilus. c (b) Dessiné sur une échelle semi-logarithmique pour mettre en évidence la linéarité du taux de croissance (ligne pointillée).
Sur la fig. 6b, c montre la biomasse des populations cellulaires dans le champ de vision en fonction du temps sur toute la période de collecte de données. La désintégration rapide de la masse sèche observée à \(t=5\)h sur la fig. 6b, c, en raison de la sortie de certaines cellules du champ de vision. Le taux de croissance de ces quatre événements est \(0,77\pm 0,1\) h-1. Cette valeur est supérieure au taux de croissance associé aux figures 3.3 et 4, où les cellules se développent normalement. La raison de l'augmentation du taux de croissance de G. stearothermophilus à partir des spores n'est pas claire, mais ces mesures mettent en évidence l'intérêt du LA-HTM et travaillent au niveau d'une seule cellule (ou au niveau d'un seul mCFU) pour en savoir plus sur la dynamique de la vie cellulaire. .
Pour démontrer davantage la polyvalence du LA-HTM et ses performances à haute température, nous avons examiné la croissance de Sulfolobus shibatae, une archée acidophile hyperthermophile avec une température de croissance optimale de 80 ° C51. Par rapport à G. stearothermophilus, ces archées ont également une morphologie très différente, ressemblant à des sphères de 1 micron (cocci) plutôt qu'à des bâtonnets allongés (bacilles).
La figure 7a consiste en des images séquentielles de profondeur optique de mCFU de S. shibatae obtenues à l'aide de CGM (voir le long métrage M7 dans les documents supplémentaires). Cette mCFU se développe à environ 73°C, en dessous de la température optimale de 80°C, mais dans la plage de températures nécessaire à une croissance active. Nous avons observé plusieurs événements de fission qui faisaient ressembler les mCFU à des microraisins d'archées après quelques heures. À partir de ces images OT, la biomasse de mCFU a été mesurée au fil du temps et présentée à la figure 7b. Fait intéressant, les mCFU de S. shibatae ont montré une croissance linéaire plutôt que la croissance exponentielle observée avec les mCFU de G. stearothermophilus. Il existe un débat de longue date 52 sur la nature des taux de croissance cellulaire : alors que certaines études rapportent des taux de croissance des microbes proportionnels à leur taille (croissance exponentielle), d’autres montrent un taux constant (croissance linéaire ou bilinéaire). Comme l'expliquent Tzur et al.53, la distinction entre croissance exponentielle et (bili)linéaire nécessite une précision <6 % dans les mesures de biomasse, ce qui est hors de portée pour la plupart des techniques QPM, même impliquant l'interférométrie. Comme l'expliquent Tzur et al.53, la distinction entre croissance exponentielle et (bili)linéaire nécessite une précision <6 % dans les mesures de biomasse, ce qui est hors de portée pour la plupart des techniques QPM, même impliquant l'interférométrie. En ce qui concerne la loi 53, la taille spécifique et (bi)linéique des taux de pollution <6% dans la biomasse n'est pas nécessaire Pour les méthodes QPM plus avancées, vous devez utiliser des interféromètres. Comme l'expliquent Zur et al.53, la distinction entre croissance exponentielle et (bi)linéaire nécessite une précision <6 % dans les mesures de la biomasse, ce qui est inaccessible pour la plupart des méthodes QPM, même en utilisant l'interférométrie.Comme l'expliquent Zur et al. 53, la distinction entre croissance exponentielle et (bi)linéaire nécessite une précision inférieure à 6 % dans les mesures de la biomasse, ce qui est inaccessible pour la plupart des méthodes QPM, même lorsque l'interférométrie est utilisée. CGM atteint cette précision avec une précision inférieure au pg dans les mesures de biomasse36,48.
a Time-lapse composé de 6 images OT (immersion dans l'huile, 60x, objectif NA 1,25) et (b) évolution de la biomasse des micro-CFU mesurées avec CGM. Voir le film M7 pour plus d'informations.
La croissance parfaitement linéaire de S. shibatae était inattendue et n'a pas encore été signalée. Cependant, une croissance exponentielle est attendue, du moins parce qu’avec le temps, de multiples divisions de 2, 4, 8, 16… cellules doivent se produire. Nous avons émis l’hypothèse que la croissance linéaire pourrait être due à l’inhibition cellulaire due à un tassement cellulaire dense, tout comme la croissance cellulaire ralentit et finit par atteindre un état dormant lorsque la densité cellulaire est trop élevée.
Nous concluons en abordant tour à tour les cinq points d'intérêt suivants : réduction du volume de chauffage, réduction de l'inertie thermique, intérêt pour les nanoparticules d'or, intérêt pour la microscopie en phase quantitative et une éventuelle plage de température dans laquelle le LA-HTM peut être utilisé.
Par rapport au chauffage résistif, le chauffage laser utilisé pour le développement HTM offre plusieurs avantages, que nous illustrons dans cette étude. En particulier, dans les milieux liquides dans le champ de vision du microscope, le volume de chauffage est maintenu à quelques (10 µm) 3 volumes. De cette façon, seuls les microbes observés sont actifs, tandis que d’autres bactéries sont en dormance et peuvent être utilisées pour approfondir l’étude de l’échantillon – il n’est pas nécessaire de changer l’échantillon à chaque fois qu’une nouvelle température doit être vérifiée. De plus, le chauffage à l'échelle microscopique permet l'examen direct d'une large plage de températures : la figure 4c a été obtenue à partir d'un film de 3 heures (Film M3), qui nécessite généralement la préparation et l'examen de plusieurs échantillons, un pour chacun des échantillons étudiés. y est la température représentant le nombre de jours de l'expérience. La réduction du volume chauffé maintient également tous les composants optiques environnants du microscope, en particulier la lentille de l'objectif, à température ambiante, ce qui constitue jusqu'à présent un problème majeur auquel la communauté est confrontée. LA-HTM peut être utilisé avec n'importe quel objectif, y compris les objectifs à immersion dans l'huile, et restera à température ambiante même avec des températures extrêmes dans le champ de vision. La principale limite de la méthode de chauffage laser que nous rapportons dans cette étude est que les cellules qui n’adhèrent pas ou ne flottent pas peuvent être éloignées du champ de vision et difficiles à étudier. Une solution de contournement pourrait consister à utiliser des lentilles à faible grossissement pour obtenir une augmentation de température plus importante, supérieure à quelques centaines de microns. Cette prudence s'accompagne d'une diminution de la résolution spatiale, mais si l'objectif est d'étudier le mouvement des micro-organismes, une haute résolution spatiale n'est pas requise.
L'échelle de temps pour chauffer (et refroidir) le système \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) dépend de sa taille, selon la loi \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), où \ (L\ ) est la taille caractéristique de la source de chaleur (le diamètre du faisceau laser dans notre étude est de \(L\ environ 100\) μm), \(D\) est la diffusivité thermique de l'environnement (moyenne dans notre cas, verre et eau Taux de diffusion\(D\ environ 2\fold {10}^{-7}\) m2/s). Donc, dans cette étude, des réponses temporelles de l'ordre de 50 ms, soit quasi-instantanées. On peut s'attendre à des changements de température. Cet établissement instantané d'une élévation de température raccourcit non seulement la durée de l'expérience, mais permet également un timing précis \(t=0\) pour toute étude dynamique des effets de la température.
Notre méthode proposée est applicable à tout substrat absorbant la lumière (par exemple, des échantillons commerciaux avec revêtement ITO). Cependant, les nanoparticules d'or sont capables de fournir une absorption élevée dans l'infrarouge et une faible absorption dans le domaine visible, ces dernières caractéristiques étant intéressantes pour une observation optique efficace dans le domaine visible, notamment lors de l'utilisation de la fluorescence. De plus, l’or est biocompatible, chimiquement inerte, la densité optique peut être ajustée de 530 nm au proche infrarouge et la préparation des échantillons est simple et économique29.
La microscopie à front d'onde à réseau transversal (CGM) permet non seulement de cartographier la température à l'échelle microscopique, mais également de surveiller la biomasse, ce qui la rend particulièrement utile (voire nécessaire) en combinaison avec le LA-HTM. Au cours de la dernière décennie, d’autres techniques de microscopie thermique ont été développées, notamment dans le domaine de la bioimagerie, et la plupart d’entre elles nécessitent l’utilisation de sondes fluorescentes sensibles à la température54,55. Cependant, ces méthodes ont été critiquées et certains rapports ont mesuré des changements de température irréalistes à l'intérieur des cellules, probablement dus au fait que la fluorescence dépend de nombreux facteurs autres que la température. De plus, la plupart des sondes fluorescentes sont instables à haute température. Par conséquent, le QPM et en particulier le CGM représentent une technique de microscopie thermique idéale pour étudier la vie à haute température par microscopie optique.
Des études sur S. shibatae, qui vivent de manière optimale à 80°C, montrent que le LA-HTM peut être appliqué à l’étude des hyperthermophiles, et pas seulement des thermophiles simples. En principe, il n'y a aucune limite à la plage de températures pouvant être atteinte avec le LA-HTM, et même des températures supérieures à 100°C peuvent être atteintes à pression atmosphérique sans ébullition, comme l'a démontré notre groupe de 38 personnes dans les applications de chimie hydrothermale à pression atmosphérique. pression A. Un laser est utilisé pour chauffer les nanoparticules d'or 40 de la même manière. Ainsi, LA-HTM a le potentiel d'être utilisé pour observer des hyperthermophiles sans précédent avec une microscopie optique standard à haute résolution dans des conditions standard (c'est-à-dire sous un stress environnemental).
Toutes les expériences ont été réalisées à l'aide d'un microscope fait maison, comprenant un éclairage Köhler (avec LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), un porte-échantillon avec mouvement xy manuel, des objectifs (Olympus, 60x, 0,7 NA, air, LUCPlanFLN60X ou 60x, 1,25 NA, huile). , UPLFLN60XOI), caméra CGM (réseau croisé QLSI, pas de 39 µm, 0,87 mm du capteur de la caméra Andor Zyla) pour fournir une imagerie d'intensité et de front d'onde, et caméra sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, mode 16 bits, de Hamamatsu) pour enregistrer le données présentées dans la figure 5 (nage bactérienne). Le séparateur de faisceau dichroïque est un bord BrightLine de 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Le filtre situé à l'avant de la caméra est un filtre passe-court 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Laser saphir titane (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, cavité laser tsunami pompée, Spectra-Physics sur la Fig. 2-5, remplacé par le laser Millenia, Spectraphysics 10 W, cavité laser Mira pompée, Coherent, pour la Fig. 2 -5). 6 et 7) sont réglés à la longueur d'onde \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, qui correspond au spectre de résonance plasmonique des nanoparticules d'or. Modulateurs spatiaux de lumière (1920 × 1152 pixels) ont été achetés auprès de Meadowlark Optics. Les hologrammes ont été calculés à l'aide de l'algorithme de Gerchberg-Saxton comme décrit dans le lien 39.
La microscopie à front d'onde à réseau croisé (CGM) est une technique de microscopie optique basée sur la combinaison d'un réseau de diffraction bidimensionnel (également appelé réseau croisé) à une distance d'un millimètre du capteur d'une caméra conventionnelle. L'exemple le plus courant de CGM que nous avons utilisé dans cette étude est appelé interféromètre à déplacement transversal à quatre longueurs d'onde (QLSI), où le réseau croisé consiste en un motif en damier intensité/phase introduit et breveté par Primot et al. en 200034. Les lignes de réseau verticales et horizontales créent des ombres en forme de grille sur le capteur, dont la distorsion peut être traitée numériquement en temps réel pour obtenir la distorsion du front d'onde optique (ou un profil de phase équivalent) de la lumière incidente. Lorsqu’elle est utilisée sur un microscope, une caméra CGM peut afficher la différence de chemin optique d’un objet imagé, également appelée profondeur optique (OT), avec une sensibilité de l’ordre du nanomètre36. Dans toute mesure CGM, afin d'éliminer tout défaut dans les composants ou faisceaux optiques, une image OT de référence primaire doit être prise et soustraite de toutes les images ultérieures.
La microscopie de température a été réalisée à l'aide d'une caméra CGM comme décrit dans la référence. 32. En bref, chauffer un liquide modifie son indice de réfraction, créant un effet de lentille thermique qui déforme le faisceau incident. Cette distorsion du front d'onde est mesurée par le CGM et traitée à l'aide d'un algorithme de déconvolution pour obtenir une répartition tridimensionnelle de la température dans le milieu liquide. Si les nanoparticules d'or sont réparties uniformément dans l'échantillon, une cartographie de la température peut être réalisée dans des zones exemptes de bactéries pour produire de meilleures images, ce que nous faisons parfois. L'image CGM de référence a été acquise sans chauffage (avec le laser éteint) puis capturée au même endroit dans l'image avec le laser allumé.
La mesure de la masse sèche est réalisée à l’aide de la même caméra CGM utilisée pour l’imagerie de la température. Les images de référence CGM ont été obtenues en déplaçant rapidement l'échantillon en x et y pendant l'exposition afin de faire la moyenne de toute inhomogénéité de l'OT due à la présence de bactéries. A partir d'images OT de bactéries, leur biomasse a été obtenue à l'aide d'un ensemble d'images sur des zones sélectionnées à l'aide de l'algorithme de segmentation maison de Matlab (voir sous-section « Code numérique »), en suivant la procédure décrite dans la réf. 48. En bref, on utilise la relation \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), où \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) est l'image de profondeur optique, \(m\) est le poids sec et \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) est une constante. Nous avons choisi \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, qui est une constante typique pour les cellules vivantes.
Une lamelle de 25 mm de diamètre et 150 µm d'épaisseur recouverte de nanoparticules d'or a été placée dans une chambre AttofluorTM (Thermofisher) avec les nanoparticules d'or tournées vers le haut. Geobacillus stearothermophilus a été précultivé pendant une nuit dans du milieu LB (200 tr/min, 60°C) avant chaque jour d'expériences. Une goutte de 5 µl d'une suspension de G. stearothermophilus avec une densité optique (DO) de 0,3 à 0,5 a été placée sur une lamelle recouverte de nanoparticules d'or. Ensuite, une lamelle ronde de 18 mm de diamètre avec un trou de 5 mm de diamètre au centre a été déposée sur la goutte et 5 µl de suspension bactérienne avec la même densité optique ont été appliqués à plusieurs reprises au centre du trou. Les puits sur lamelles ont été préparés conformément à la procédure décrite dans la réf. 45 (voir Informations supplémentaires pour plus d’informations). Ajoutez ensuite 1 ml de milieu LB à la lamelle pour éviter que la couche liquide ne se dessèche. La dernière lamelle est placée sur le couvercle fermé de la chambre Attofluor™ pour éviter l'évaporation du milieu pendant l'incubation. Pour les expériences de germination, nous avons utilisé des spores qui, après des expériences conventionnelles, recouvraient parfois la lamelle supérieure. Une méthode similaire a été utilisée pour obtenir Sulfolobus shibatae. Trois jours (200 tr/min, 75°C) de culture préliminaire de Thiobacillus serrata ont été réalisés dans le milieu 182 (DSMZ).
Des échantillons de nanoparticules d'or ont été préparés par lithographie de copolymère séquencé micellaire. Ce processus est décrit en détail au Chap. 60. En bref, des micelles encapsulant des ions or ont été synthétisées en mélangeant le copolymère avec HAuCl4 dans du toluène. Les lamelles nettoyées ont ensuite été immergées dans la solution et traitées par irradiation UV en présence d'un agent réducteur pour obtenir des graines d'or. Enfin, les graines d'or ont été cultivées en mettant en contact une lamelle avec une solution aqueuse de KAuCl4 et d'éthanolamine pendant 16 minutes, ce qui a abouti à un arrangement quasi-périodique et très uniforme de nanoparticules d'or non sphériques dans le proche infrarouge.
Pour convertir les interférogrammes en images OT, nous avons utilisé un algorithme maison, comme détaillé dans le lien. 33 et est disponible sous forme de package Matlab dans le référentiel public suivant : https://github.com/baffou/CGMprocess. Le package peut calculer l’intensité et les images OT sur la base des interférogrammes enregistrés (y compris les images de référence) et des distances du réseau de caméras.
Pour calculer le modèle de phase appliqué au SLM afin d'obtenir un profil de température donné, nous avons utilisé un algorithme maison développé précédemment et disponible dans le référentiel public suivant : https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. L'entrée est le champ de température souhaité, qui peut être réglé numériquement ou via une image BMP monochrome.
Pour segmenter les cellules et mesurer leur poids sec, nous avons utilisé notre algorithme Matlab publié dans le référentiel public suivant : https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Sur chaque image, l'utilisateur doit cliquer sur la bactérie ou le mCFU qui l'intéresse, ajuster la sensibilité de la baguette et confirmer la sélection.
Pour plus d’informations sur la conception de l’étude, consultez le résumé du Nature Research Report lié à cet article.
Les données étayant les résultats de cette étude sont disponibles auprès des auteurs respectifs sur demande raisonnable.
Le code source utilisé dans cette étude est détaillé dans la section Méthodes, et les versions de débogage peuvent être téléchargées depuis https://github.com/baffou/ dans les référentiels suivants : SLM_temperatureShaping, CGMprocess et CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Aperçu des thermophiles et de leurs applications à large spectre. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Aperçu des thermophiles et de leurs applications à large spectre.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. et Sharma, AK Aperçu des thermophiles et de leur large application. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. et Sharma, AK. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. et Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. et Sharma AK Une compréhension approfondie des thermophiles et un large éventail d'applications.3 Biotechnologie 6, 81 (2016).
Heure de publication : 26 septembre 2022